文章来源：IVD学习笔记
信息来源：基因谷
公元前400多年，古希腊的“医学之父”希波克拉底观察到人体内有一种肿胀物能够在体内快速生长，在扩散过程中该肿胀物会伸出许多像手指一样的触角，形似螃蟹，故用螃蟹的拉丁语“carcinos”及“carcinoma”来命名这种疾病。
虽然很早就定义了癌症这种疾病，但直到文艺复兴之后，人们对于癌症的认识才逐渐深入。
著名的苏格兰外科医生约翰·亨特(John Hunter，1728—1793)曾提出，一些癌症可以通过手术治愈，并描述了外科医生如何决定手术治疗哪些癌症。威廉·哈尔斯特德(William Halsted)在1882年进行了第一次根治性乳房切除术来治疗乳腺癌。直到20世纪下半叶，这种外科手术仍然是乳腺癌的标准手术。
本文章从肿瘤的诊疗历史谈起，对肿瘤NGS检测包括NGS测序的历史进行梳理，让大家能够了解这个行业发展的脉络。
肿瘤诊疗的发展里程碑
人类与癌症的斗争从未停止，随着时间的推移，逐步发展出手术治疗、激素治疗、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种手段。
化疗药物对肿瘤细胞的选择性低，不能分辨肿瘤细胞和正常细胞，对两种细胞均会“格杀勿论，狂轰滥炸”，在杀灭癌细胞的同时也损伤了部分正常细胞，出现“杀敌一千，自损八百”的尴尬局面，且有较大的毒副作用。
靶向治疗就是在治疗癌症的时候，像射箭一样，只针对患病的部分用药，而不伤及健康的部分。而实现靶向治疗的关键是如何找到靶子，也就是需要通过基因检测来找到靶标位置。
免疫治疗主要是激活人自身的免疫系统，让免疫细胞去杀灭癌细胞和肿瘤组织。它直接作用的不是肿瘤细胞或组织，而是激活人体自身的免疫系统，最终杀死肿瘤细胞。免疫治疗也不是针对所有患者都适用，同样依赖于基因检测进行个体化治疗。
随着人类对肿瘤研究的不断深入，抗肿瘤药物的不断发展，对于肿瘤的治疗进入了精准医疗阶段。肿瘤存在高度异质性，不同患者间在疾病进展、治疗敏感性及预后等方面的差别巨大，对肿瘤的诊断从传统形态学分型转变到分子分型，可实现“同病异治”或“异病同治”。基因检测有助于癌症的精准诊断、预测和预后、治疗指导、复发监控及药物研发，从而使得患者获益最大化。
我国肿瘤基因检测的市场也逐年增加，基因检测的高速发展，离不开检测技术，尤其是NGS技术的不断发展以及成本的不断下降。
基因测序技术的发展历史
2001年
6个国家的科学家花了11年的时间、30亿美元，共同发表首个人类基因组工作草图。
2003年
全世界最早的人类全基因组参考序列公布，宣布完成人类基因组计划。人类基因组测序的完成，极大地推动了基因检测技术的发展。
2005年
454 Life Sciences 推出了第一款二代测序仪，开启了二代测序的先河。454技术是基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，是一种边合成边测序(sequencing by synthesis, SBS)的技术，比传统的Sanger测序快100倍。454 Life Sciences用新一代测序仪对DNA双螺旋结构的发现者James Watson进行了基因组测序。
2006年
英国剑桥的Solexa公司推出基于边合成边测序(sequencing by synthesis, SBS)技术的高通量测序仪。ABI斥资1.2亿美元收购了遗传分析公司Agencourt Personal Genomics(APG)。
2007年
Roche(罗氏)以1.55亿美元现金和股票收购了454 Life Science，为Roche在此后几年成为二代测序市场的领头羊奠定基础。Roche完成对双螺旋结构的发现者James Watson的基因组测序，花费100万美金。Illumina以6亿美元收购Solexa，开启二代测序新纪元。
ABI推出SOLiD高通量测序仪，SOLiD系统是通量最高的新一代测序平台，每次运行可以产生4 Gb的数据。此外，由于它采用双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，能够区分测序错误和多态性，故原始数据的准确性接近99.95%，高于其他的新一代测序平台。
2008年
Illumina宣布将人类基因组测序费用降至10万美元。ABI宣布，利用SOLiD测序平台，人类基因组的测序成本低于6万美元。
2010年
Illumina推出HiSeq2000系列测序仪，在测序通量上做了长远的布局。454 Life Sciences的创始人乔纳森·罗森伯格(Jonathan Rothberg)创办了新的科技公司Ion Torrent，并于2010年成功推出了当时世上体积最小、检测成本最低的测序仪PGM。
Ion Torrent被Life Technologies公司收购。而这家Life Technologies公司，正是由ABI公司与Invitrogen公司合并而成!Life technologies的Ion Torrent表现不俗，在NGS竞争中扳回一局。
2014年
Life Technologies 又被 Thermo Fisher Scientific Corporation(赛默飞世尔) 以136亿美元收购。Thermo Fisher Scientific可以量产临床级别的测序仪，占据了一定的市场份额。
2016年
Roche在Illumina的通量和价格的双重夹击下遭受沉重的打击，黯然宣布关闭454。
2017年
Illumina将人类基因组测序成本降低到了1000美元，率先实现了“一千美元测序一个人类基因组”的设想。由此，Illumina垄断了超过80%的NGS测序市场，紧随其后的Themo Fisher市场占有率仅为不到10%，Roche仅为5%左右，排名前三的厂商总市场占比超过98%。
近几年国产测序平台华大智造在NGS领域也占得了一席之地。华大和Illumina的竞争更多的是专利竞争。
得益于NGS技术的不断更新和成本的不断降低，肿瘤基因检测的应用场景越来越广泛，检测的基因数目和突变类型越来越丰富，市场上也出现了利用不同技术、针对不同应用场景的各种产品。
基于NGS的肿瘤基因检测
2015年1月，美国总统在国情咨文演讲中宣布了美国的精准医学计划，尝试通过收集基因组学和其他分子信息为患者提供个性化医疗。随后，中国科技部于2015年3月召开了国家首次精准医学战略专家会议，并计划在2030年前投入600亿元加速中国精准医疗的行业发展。
截至目前，FDA已批准的伴随诊断产品已达45个，来自16个伴随诊断公司。自从2016年首款NGS伴随诊断产品上市，NGS因其检测通量高、更节约样本、可获得更全面的信息、可分析MSI和TMB等多维度分子靶标、能更准确地指导临床等优点在肿瘤基因检测的应用中发展迅速。5年内已有7个NGS产品获得了FDA批准。其中有3款是大panel产品，分别是FoundationOne CDx，Foundation Liquid和Guardant360;有1款是同源重组修复缺陷产品Myriad myChoice。
NMPA相继批准了15款基于NGS的多基因检测试剂盒。值得注意的是，这些获批的产品均检测少数几个基因，属于小panel产品。但肿瘤发生发展机制复杂，随着对肿瘤基因组研究的不断深入，发现的与肿瘤治疗相关的基因、标志物也越来越多。实现肿瘤精准分子分型需要检测的基因、变异类型越来越多，小panel产品很难满足不断发展的肿瘤基因检测的各种场景。能一劳永逸实现对不同肿瘤的多方位检测，这是美国FDA给基因检测企业提出的要求。
纵观美国FDA批准的肿瘤NGS检测产品(Foudation Focus CDx BRCA ➝ Oncomine Dx Target Test ➝ Praxis Extended RAS Panel ➝ MSK-IMPACT 468基因 ➝ FoundationOne CDx 324基因)，我们可以发现肿瘤NGS检测的未来发展趋势一定是从单一癌种到多癌种，单基因到多基因，小panel到大panel。截至目前，国内尚未有大Panel产品获批。
从适用范围看，用于非小细胞肺癌治疗的伴随诊断试剂最多。
CSCO指南针对非小细胞肺癌患者进行EGFR突变、ALK融合、ROS1、RET融合及MET14外显子跳跃的基因检测进行了I级推荐，针对BRAF V600E突变、KRAS突变、HER2扩增/突变，MET扩增以及NTRK融合的基因检测进行了II级推荐，针对基于NGS技术进行TMB检测进行了III级推荐。相应的伴随药物主要集中在吉非替尼、埃克替尼、奥希替尼、克唑替尼等。
在其它各类肿瘤的各种指南中也有对基因检测的广泛推荐，并指导基因诊断产品服务于临床，为患者谋求更大的获益。
当前，肿瘤基因检测产品主要针对组织样本，可以通过病理学诊断找到肿瘤区域，获得较高浓度的肿瘤DNA，检测难度相对较低。另外，绝大部分产品都通过杂交捕获法进行建库，测序步骤则几乎相同，所以产品的灵敏度和特异性都比较接近，虽然各产品的生信分析方法不尽相同，其底层技术是类似的。
临床上，很多身体虚弱的晚期肿瘤患者，没办法进行手术和穿刺，或患者出现多处转移，组织不是很好取，或取得的组织样本量达不到基因检测的需求。肿瘤基因检测陷入了“巧妇难为无米之炊”的境地。
此外，手术后的患者，术后的预后评估、辅助治疗方案的评估、复发监测等临床关心的问题，也需要通过基因检测以获得更多的指导。利用血液等体液样本进行的液体活检，由于无创且可多次取样，能很好地解决上述难题。
2018年，美国Guardant Health公司发布了史上最大规模的ctDNA检测研究结果，Guardant 360平台检测了15191例患者的17628份血浆标本和398位患者的组织标本，结果表明，液体活检和组织检测具有相当高的一致性。2020年，FDA先后批准了Guardant360 CDx和Foundation one CDx两款通过液体活检进行肿瘤伴随诊断的产品。
无论是基于组织的检测，还是液体活检，肿瘤基因检测的重要挑战都是检测的灵敏性和特异性。肿瘤基因检测的操作步骤包括核酸的提取、PCR扩增和测序文库的构建、基因序列读取等。这些过程中都会带来检测误差。检测时如何排除掉误差带来的突变，真正能检测出每个患者不同的突变，同时兼顾检测覆盖的基因范围和检测准确度，这是肿瘤基因检测的一个重要难点。
此外，具有临床指导意义的突变，即可诉性突变，在肿瘤组织中的占比常常较低，而在体液中更低(比如ctDNA中的突变)。为获得准确的可诉性突变信息，常常需要加大测序深度，这无可避免地造成了测序成本的提高。如何高特异性高灵敏度地检测可诉性突变是基于NGS的肿瘤基因检测的关键问题。
利用基于组织开发的肿瘤基因检测panel来检测血液中的ctDNA，虽然在加大测序深度的情况下能一定程度提高测序的最低检测下限，但由于杂交捕获效率和样本投入量的原因，很多低频突变无法被捕获，组织检测产品应用于液体活检仍存在一些问题。液体活检的痛点，依赖于底层技术的突破。
阅尔基因发明了抑制探针置换扩增技术(Blocker Displacement Amplification，BDA)。
BDA就像一个放大镜，特异地放大了组织内突变型分子的信号，并大大抑制了野生型序列的扩增，可以更便捷更省力地检测到关键的信号。
QASeq技术(Quantitative Amplicon Sequencing)是另一项专利技术。QASeq是通过加唯一性分子标签(Unique Molecular Identifier, UMI)的方法，去除PCR和基因测序过程产生的错误;并通过多重PCR设计，对DNA序列进行绝对定量，大大提高拷贝数变异分析的灵敏度。此外，通过将扩增子引物设计在热点突变两端，QASeq也可以检测基因突变。
BDA可以特异富集低频突变，大大降低对野生型的不感兴趣分子的扩增，这样的特征使得其特别适用于液体活检、MRD监测等需要超过灵敏度的应用场景，使液体活检真正走向实用化。通过将mBDA技术和QASeq技术整合，推出qBDA技术：首先在DNA分子加UMI标签，其次进行mBDA扩增。
利用qBDA技术，其最低检测下限可达十万分之五，满足MRD检测所需的检测灵敏度，同时检测数据量又很少，可应用于中低通量测序平台，使检测成本、硬件成本、时间成本都大大降低，满足院内去中心化检测的需要，更有助于NGS检测常规化的实现。
结 语
随着人类对肿瘤的认识越来越深入，肿瘤的诊疗对分子检测的依赖性越来越高，对于其检测的要求也越来越精确，催生了检测技术的不断革新。NGS的发展与肿瘤基因检测的发展紧密相随，正是因为NGS技术的成本不断下降，以及检测技术的不断创新，才有肿瘤基因检测市场的繁荣。
未来肿瘤基因检测发展的趋势，必然是要求数据量合适，灵敏度高，特异性强，成本低，适用于中低通量测序平台，这样才能推向各级医院，从而造福更多患者。归根结底，满足这些要求，需要向无数前贤智士学习，不断推进底层技术的创新，并将这些创新迅速应用于临床检测。
参考资料：
1.The History of Cancer | First Cancer Diagnosis
2.Milestones in Cancer Research and Discovery - NCI
3.综述 | 人类肿瘤药物发展史
4.PD-L1前世今生：从诺贝尔奖说起_免疫
5.Meet John: Johns Hopkins Kimmel Cancer Center
6.华大基因想干大事：收购美国测序仪公司CG 打通产业链
7.华大智造赢得对Illumina专利诉讼 获赔3.34亿美元
8.中国肿瘤分子诊断蓝皮书
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