学术天地｜定向进化之常用的文库构建方法介绍

常用的文库构建方法有易错PCR、全质粒大引物PCR、饱和突变、DNA改组、体外随机重组、交错延伸等方法。

易错PCR(Error-Prone PCR)，是最常用的创建随机突变文库的方法。这种方法利用Taq酶低保真度的特点，辅以高浓度的Mg2+和Mn2+，提高扩增体系碱基发生错配的概率，理论上能覆盖所有的突变体。但突变文库中会存在假阳性，受模板质粒影响较大，有效去除模板质粒是此方法的关键。

全质粒大引物PCR(Megaprimer PCR of Whole Plasmid, MEGAWHOP)，这种方法克服了易错PCR产物酶切、连接的缺陷，即模板质粒的影响。全质粒大引物PCR法主要分为四个步骤，即制备DNA大引物、PCR扩增全质粒、DpnI处理PCR产物和转化。

饱和突变(Saturation Mutagenesis)是指靶位点氨基酸置换成其他19种氨基酸的突变方法。根据基本原理可分为寡核苷酸定向突变、盒式诱变、重叠延伸PCR等方法，不同方法有各自的优缺点，可根据实际情况进行选择。

表1 不同饱和突变方法优缺点

DNA改组(DNA Shuffling)是利用DNaseI对突变的目的基因进行酶切，使目的基因形成许多不同大小的随机片段，再利用这些片段进行无模板扩增，随机片段互为引物和模板，在扩增过程中重组，得到突变体。

目的基因可通过易错PCR获得，但改组时无引物PCR组装可能全部来自同一个亲本，突变效率降低。因此，利用基于ssDNA的DNA家族改组(DNA Family Shuffling)能够降低来自亲本的影响。将亲本目的基因进行5’磷酸化，再利用λ核酸外切酶降解双链DNA，得到ssDNA，将ssDNA等摩尔比混合后再利用DNaseI进行酶切和PCR扩增。

图3 DNA Shuffling原理示意图

体外随机重组(Random-Priming in Vitro Recombination, RPR )是以单链DNA为模板，辅以兼并引物，产生互补于模板不同位点的短DNA片段，短DNA 片段中会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行重组成完整的基因长度。

图4 体外随机重组原理示意图

交错延伸(Staggered Extension Process, StEP)，实际上是两次PCR过程。第一次PCR中只设置退火和延伸，退火和延伸时间只设置5-15 s以获得短片段，第二次PCR设置标准PCR以扩增全长基因。

图5 交错延伸示意图

以上是构建突变文库常用的一些方法介绍，除此外还有RACHII、ITCHY等方法，需配合高效的筛选方法才能达到高通量筛选的目的。