2022超全“PCR异常曲线”分析! 你还不知道？！！

随着实验的进行，扩增产物不断累积，相应的荧光信号也不断在增加，每进行一个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（比如40个循环），就可以得到下面的扩增曲线图（横坐标代表扩增的循环数cycle，纵坐标代表荧光的强度）。

这其中还需要弄清楚一些基本概念，如：

做标准曲线有啥用？标准曲线可以用来确定未知的样品的初始量。如果是需要绝对定量，是必须要有标准曲线的。

怎么做呢？每个模板的CT值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系的，起始的拷贝数越大，CT值就越小。标准品按照一定的倍数稀释5-6个浓度左右，根据RT-PCR的反应条件进行反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得来。

那么，问题来了，这个标准曲线的标准品怎么确定呢？

（1）如果是做绝对定量，标准品的要求比较高，这个的制备过程也相对复杂一些，但结果也更加精确。

要求：

必须是准确定量的、标准化的、稳定的质粒DNA（也可以是基因组DNA，纯化后的PCR产物等），

5-6个稀释梯度；

PCR反应仪器要同一种，并且同时操作；

反应的条件一致：反应体系、参数等等；

反正能一致的都一致就对了。

（2）如果只是想看看扩增效率（E）（E=10-1/斜率），检验PCR的反应体系是否符合要求，我们有时候也采用待测试样品作为标准品，逐步稀释后进行反应，最终看标准曲线的斜率和R2是否符合要求，我比较懒，常会用这种方法，不过有些发文章的要求会比较高，那还是要乖乖去做的。

简单点说，就是考察染料标记法结果的特异性的。再简单点，就是分分钟确定你的引物是否有效。

复杂的原理我就不解释了，关键是怎么看和怎么判断。如果反应产物单一，曲线会出现一个尖峰；如果有二聚体或者非特异性的扩增，就会出现至少两个峰或者更糟糕。采用SYBR Green染料时是必须要做溶熔解曲线的，毕竟这是一个非特异性的染料。

在实验中，大家还是会碰到很多问题的，下面列举几个比较常见的问题：

（1）扩增曲线经过40个循环后没有平台期？或者扩增曲线根本无法呈现指数上升？

这种情况下很有可能是你的起始模板浓度太低了，即便经过40个循环也是达不到平台期的，可以通过增加循环数来验证是否是该问题。

（2）熔解曲线的问题：比如多个峰，或者尖峰的前面有个小小的小峰，或者没有峰？

这个跟引物以及反应的体系温度有关系，如果说没有峰值或者杂乱无章，很有可能是引物的问题，建议重新设计引物。有时候有小的峰，可以通过优化反应条件，比如退火温度的优化来消除这个影响。

常见异常曲线分析：

对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是，需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。

耗材对于荧光定量PCR来说比较重要，很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的耗材相关问题包括：1）错误使用成普通PCR仪器所对应的耗材

普通PCR耗材一般透光度比较差，会造成荧光扩增曲线异常，比如打折的扩增曲线（图三）。

图三：错误使用普通PCR耗材的结果

2）未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材

荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种，如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好（图四），或者溶解曲线多峰（非特异扩增），甚至是假阴性结果；

2）未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材

荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种，如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好（图四），或者溶解曲线多峰（非特异扩增），甚至是假阴性结果；

图五：质量不好的耗材引起荧光值不稳定图（上）

如果使用的PCR反应板封膜质量不好，在PCR过程中受到水蒸气的影响，容易产生变形（图六），这样会引起“optical warping”，即“光学扭曲”现象（图七 左图），该实验中由于使用了ROX作为参比染料，ROX有效的校正了这种荧光信号的变化，均一化的扩增图结果是正常的。

图六：PCR过程中水蒸气使得封膜变形

图七：光学扭曲结果图及ROX均一化结果图

除了耗材外，跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确，比如配套的8联管托架，在使用的时候只用托架的下半部分，如果忘记把上半部分取下，有可能会影响扩增（图八）。

图八：未将托架上半部分取下，造成有些靶标未扩增

如果设置都正确，耗材及配件也都没问题，但是扩增曲线还是异常，这时候要确定下所用试剂是否正常。

首先要确定试剂是否有效，包括查看试剂是否在有效期内，是否反复冻融多次，运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号，结合实验中的阳性对照结果，确定试剂的有效性。其次要观察扩增完的试剂体积，如果在扩增过程中有试剂的蒸发，可能会引起扩增曲线抬升现象，如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光，ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增，还是蒸发。

比如反应体系存在蒸发，水分丢失，ROX浓度会增加，ROX参比荧光上抬（图九左图），而正常孔中ROX荧光会一直不变（图九右图），所以在加完试剂上机前，一定要检查耗材是否已经密封，防止试剂蒸发，试剂蒸发严重的还可能导致整个实验室的气溶胶污染。

图九：试剂蒸发引起扩增曲线抬升

如果以上都正常，还要确定下实验过程中的操作细节。

比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品，如果不是梯度稀释标准品，可能会引起标准曲线扩增效率或者R²值异常；

从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，会影响后面的扩增；

定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过PCR体系的20%），更容易发生optical mixing现象。

因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的PCR过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了（图十）。

图十：样本跟预混液未混匀现象

还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡，有气泡的话，中间容易形成折射，干扰荧光的采集（图十一）。所以实时荧光定量PCR实验的细节还是要特别注意的。