一文了解核酸芯片的原理、分类及技术亟待解决的问题

20世纪80年代中期俄罗斯恩格尔哈得分子生物学研究所在世界上最早提出以杂交法进行核酸序列测定的思路（Sequence by hybridization, SBH）。当时使用的是八聚寡核苷酸探针。与此同时，英国牛津大学的Southern也取得了在固相载体上固定探针进行杂交测序的国际专利。核酸芯片由此而诞生。但是核酸芯片技术的真正兴起则应归功于Affymetrix公司始创的光引导原位化学合成技术，并由此而诞生的可用于全基因组分析的高密度和超高密度核酸芯片。

所谓核酸芯片（gene chip）也叫基因芯片、DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray），是指采用原位合成（in situ synthesis）技术或微量点样技术，将数以百计或者数以万计的DNA探针固定于固相支持物表面，从而产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行和高效的检测及分析。和传统的计算机芯片相同，核酸芯片技术的核心思想同样是集成化，并且在制作上借鉴了很多源于前者的成熟技术。核酸芯片技术的诞生与基因组和后基因组时代的需求相适应，以其本身所具有的革命性优势，作为一种强有力的分析工具，必将在生命科学、医学及其他相关学科中扮演重要角色。

对于核酸芯片，可供选择的固相载体包括硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等。制作阵列时，先对固相载体做适当化学处理，然后采用光引导原位化学合成技术可以在固相载体的表面合成高密度寡核苷酸探针，或者将事先合成好的寡核苷酸探针或经纯化定量的PCR产物，按照预先设定的模式，由计算机控制的点样机器人准确、快速地点到载体表面，然后经过相应的化学处理即可获得可供使用的核酸芯片。在点样式芯片技术方面，必须提到的是斯坦福大学的Brown实验室，他们建立了一整套适合于小型实验室的核酸芯片操作规程（从点样仪的搭建、点样、固定、杂交到结果分析），并将之与国际学术界共享。

一般实验室采用的是通过在PCR的过程中掺入荧光素来标记靶片段，达到对待测靶分子的标记作用。如果被分析样品是mRNA，则一般是在反转录的过程中引入荧光标记。

Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统，即桥式PCR。具体做法如下：首先针对样品中待检测的多个靶片段设计并合成引物，然后按照预先设定的模式固定到一个特定的固相载体表面，再通过一种桥式级联放大技术来同步扩增多个靶DNA分子，这种方法的最大优点是避免了PCR技术在临床应用时的最大难题一残留污染，同时避免多重扩增时不同扩增之间的相互竞争，这一技术的缺点是扩增效率不高。此外，Lynx Therapeutics公司也提出了一个革新方法，即大规模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）。这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为快速，有效。

对于不同的芯片类型和实验目的，样品与探针的杂交条件以及杂交后的清洗条件均不相同。对于寡核苷酸芯片，杂交条件需要严格加以控制，尤其是在做单点突变检测或者SNP检测时。一般的做法是在比探针的Tm值低5~12℃的条件下做预实验，然后在预实验的基础上进行调整。当探针数目较多时，如何使同一点阵中的多个探针在相同的温度和离子浓度下均能有效而特异的杂交是寡核苷酸芯片研究中的一个核心问题。因此，在寡核苷酸芯片中探针的设计显得尤为重要，除了要考虑统一Tm值之外，还需要鉴定探针的特异性，将交叉杂交的可能性降至最小。

对于cDNA微阵列，由于探针一般是变性的PCR产物，因此对杂交条件的控制要求不如寡核苷酸芯片高。对于用来做表达分析的寡核苷酸或cDNA微阵列芯片，在定量上要求较高，所以在实验中需要加入高、中、低三种拷贝的对照，而且定量的结果需要用传统的方法如Northern杂交或者定量PCR加以验证。

待测样品一般采用荧光标记，目前常用的荧光标记物为Cy3和Cy5，它们属于花菁类荧光染料，荧光量子产率较高，且有与之配套的成熟检测设备，如CCD或者激光共焦显微镜。在杂交后的清洗步骤中，没有结合上的核酸分子、吸附在芯片表面的核酸分子和与探针没有完全配对的分子均可以去除。然后在相应的激光器的激发下，只有阳性杂交点上才会出现荧光信号。

对于cDNA微阵列，阳性点的信号强度与样品中某种特定的mRNA的量成正比，因而会得到一张各点的颜色和亮度均不相同的杂交图谱，然后需要借助特定的分析软件来分析量化的结果，以发现在某一外界刺激条件下表达呈现显著变化的基因，从而指导药物筛选、动植物发育、发病机理等方面的研究。现在有多种比较成熟的微阵列DNA芯片杂交图谱分析软件，如Gene Spring（Silicon Genetics，Redwood City，CA）、GenePix3.0（Axon Instruments，Inc.，Union City，CA）以及Imagene（BioDiscovery，Inc.，4640 Admiralty Way，CA90292），这些软件各有其优缺点。

目前芯片结果检测方面还有一些其他的方法，如质谱法、化学发光法、滚环复制法(rolling cycle amplification，RCA)、光导纤维荧光检测法。总的发展趋势是更灵敏、更快捷、更廉价、更简单，同时尽量减少对于大型贵重仪器的依赖。

核酸芯片作为一种被广泛应用并且迅猛发展的技术平台，目前尚无统一的分类方式。根据探针类型可将分为寡核苷酸微阵列芯片和cDNA微阵列芯片。从对被分析对象的操作方面来讲可将其分为被动式芯片和主动式芯片。

按照探针合成和固定两步的时间顺序，寡核苷酸微阵列芯片在制作上又可以分为在片法（on chip）和离片法（off chip）。

1、在片法

在聚合反应前要先使用作原位合成的支持物表面衍生出羟基或氨基并与保护基建立共价连接；为使作点样用的基质材料的表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包氨基硅烷或多聚赖氨酸等。

原位合成法主要为光引导合成技术，它不仅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导原位化学合成技术是光刻技术（photolithography）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。光刻技术是微电子工业中在半导体硅片上制作集成电路所广泛使用的一种技术方法。而固相合成技术则是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为在芯片表面合成高密度核酸探针及寡肽阵列提供了一条快捷的途径。

以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使基质材料羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取适当的掩模（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。这样，光通过掩模照射到基质材料上，受光部位的羟基脱保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制掩模的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点平行合成预定序列寡核苷酸的目的。

利用该方法可以用较少的步骤合成大量的探针阵列。例如，合成4^8（65536）个探针的八聚体寡核苷酸序列仅需4×8=32步操作，8小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量将非常大。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达10^6/cm2。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到95%，而通常固相合成反应每步的产率在99%以上，因此，探针的长度受到了限制。而且由于很难彻底去除每步的保护基团，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此MeGall将光引导原位合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率提升到了98%。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值后保护剂就会解离。另外，该方法同时也解决了由于掩模透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了合成点阵的密度。

另据报道，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到10^10/cm2。优派公司(Xeotron)开发了一套不同于Affymetrix的光引导原位合成技术一镜阵法。这种方法的核心在于将数字光刻技术应用到了平行化学合成上。在这种方法中首先采用计算机控制投影设备而产生一个光投射模式（类似在报告中常用到的powerpoint文档)，在每一步反应过程中就会有一种特定的光投射模式照到芯片的表面，被光照射到的位置就会被选择性地去保护，引入一个特定的单体从而实现一步合成。在这种方法中，一个特定的光投射模式就相当于一块掩模板，而光投射模式可以采用计算机方便的生成，因此与Affymetrix的技术相比具有灵活、高性能、低成本的特点。

除了光引导原位合成技术外，有的公司如美国Incyte Pharmaceuticals公司使用压电打印法进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则与一般的固相原位合成技术无异。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到99%以上。

尽管如此，原位合成法仍然比较复杂，除了Affymetrix等个别公司使用该技术合成探针外，其他中小型公司大多使用离片合成后的点样法。

2、离片法

该方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA或多肽固相合成仪完成，只是合成后需用专门的自动化微量点样装置将其以比较高的密度点印到硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。点样有多种方式，目前的主流是凹型钢针，一次蘸样可以完成多片点样，其他的还有实心钢针，毛细管以及喷点等。基质材料应事先进行特殊的化学处理，例如包被带正电荷的多聚赖氨酸或氨基硅烷。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国Biodot公司的点膜产品以及Cartesian Technologies公司的PixSys NQ/PA系列产品。前者产生的点阵密度可以达到400点/cm2，后者则可达到2500点/cm2。

cDNA微阵列芯片是由固定于基质材料上的cDNA片段组成的微阵列，这种核酸片段通常是纯化后的PCR产物，未知序列的cDNA靶分子标记后（如荧光标记）与芯片上的探针分子杂交，通过激光共聚焦荧光扫描仪或电荷耦合器件（CCD）对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行定量分析。

早在20世纪80年代初期，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片，以对大量的遗传信息进行分析。但直到1994年Pease等人发明的光引导原位化学合成高密度寡核苷酸阵列制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。在DNA芯片获得突破之后，又建立了通过精密机械手将核酸探针定位排列到基质材料上的cDNA微阵列点样技术，为芯片的大规模制作奠定了基础。

cDNA芯片的发展与双色荧光探针杂交系统的建立有密切关系，将两个不同样品的mRNA（例如经过药物和没有经过药物处理的酵母细胞mRNA）在反转录时用不同的荧光染料进行标记，再将两组样品的cDNA混合后进行杂交。对同一探针位点，在两组不同的激发光下进行检测，便可获得该位点上两个不同样品的杂交信号，其比值经合适的教学统计方法进行归一化校正后，就是该基因在两个不同样品中差异表达的比值。该系统可以很好地克服检测过程中某些不稳定或不确定因素带来的不利影响，从而可以用于基因表达差异的研究。

cDNA芯片可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块小芯片上，对来源不同的个体（正常人与患者）、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下的细胞内mRNA的相对丰度进行检测。从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和判断，迅速将某个或某些基因与疾病联系起来，极大地加快对这些基因功能的确定，同时也可进一步研究不同基因间的相互关系。

被动式核酸微阵列芯片特指那些表面没有物理作用力产生的元件的芯片。反应主要依赖于样品中的核酸分子的自由扩散。通常反应所需的时间较长，杂交的效率和特异性不高。

与被动式芯片不同，主动式芯片的表面上有通过微加工技术构造的各种微型元件，这些元件可以产生各种各样的物理作用力，如电场力、磁场力以及声场力，在这些物理场的作用下，杂交的特异性以及效率可以大大提高。目前在这方面的报道较少。国际上在主动式芯片领域处于领先地位的公司为Nanogen，Caliper Technologies，Aclara以及AVIVA Biosciences等。在他们中间AVIVA是唯一能够在同一张芯片上产生多种作用力的公司，并且可以根据实际需要选择其中的一种或多种作用力。与被动式芯片相比，主动式芯片的优势在于反应速度快、特异性好、灵敏度高。

尽管核酸芯片技术已经取得了长足的发展，受到世人瞩目，但仍然存在一些尚未解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较狭窄等。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。

在样品制备方面，当前多数公司在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度，但仍有不少人在尝试绕过该步骤，这包括Mosaic Technologies公司的固相PCR扩增体系以及Lynx Therapeucs公司提出的巨量并行固相克隆方法，两种方法各有优缺点，目前尚未达到实际应用阶段。因此现有的芯片技术均采用先扩增后杂交的办法。

制作高密度的探针阵列时，探针的合成与固定比较复杂。目标分子的标记费时间，如何简化或绕过这一步现在仍然是个问题。

目标分子与探针的杂交也会出现一些问题：首先，由于探针位于固相表面，点样量少，并存在一定程度的空间阻碍作用，从而降低了整个杂交的灵敏度。2001年7月份的Nature Biotechnology报道了聂书明小组开发的荧光编码纳米小球在核酸分子多重检测上的应用。由于纳米小球是在均相中与目标分子反应，所以反应效率远远高于传统的二维生物芯片，但是在结果的检测或者说纳米小球的解码上，目前尚无有效的方法。其次，探针分子的GC含量、长度以及浓度等都会对杂交产生一定的影响，并且很难保证芯片上所有的探针分子在一个温度、一种缓冲液下充分杂交。这使得目前的一些核酸芯片灵敏度还不如现有的PCR以及ELISA技术。

在信号的获取与分析方面，当前多数方法使用荧光法进行检测和分析，其原理是探针与样品完全配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5~35倍，所以必须对荧光信号强度精 确测定。但荧光检测法存在的问题是，只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行分辨。

总之，核酸芯片要成为实验室或临床可以普遍采用的技术仍有如下关键问题亟待解决：

①杂交特异性的提高；

②样品制备和标记操作的简化；

③信号检测灵敏度的提高；

④高度集成化样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发。

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