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文章来源：MIR医学仪器与试剂 编辑部
目前，PCR扩增技术已经成为生物学研究的基础。1985年Kary Mullis发明了聚合酶链反应，标志着PCR技术的诞生；1992年，Higuchi提出qPCR（实时荧光定量PCR）技术；1999年，Vogelstein提出了第三代dPCR（数字PCR）概念。30多年以来，人们为了解决研究中出现的问题与需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR到qPCR再到dPCR，PCR技术不断更新迭代，在遗传鉴定和疾病诊断中发挥着巨大作用，并且在日益广阔的医学诊断领域中展现出新的生命力。
今天，小编就为您科普一下qPCR和dPCR两种方法学究竟有何差异？检测原理：qPCR主要使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。qPCR 主要依赖于标准品制备标准曲线，进而确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。随着PCR循环进行，染料荧光强度增加，从而检测到定量反应的DNA。SYBR Green是一种DNA插入染料，广泛用于qPCR。虽然SYBR Green方法比探针方法便宜，但是特异性没有荧光探针方法好。
检测流程：小编以qPCR检测人乳头瘤病毒DNA为例，阐述检测流程。
2、配置qPCR反应体系。各组分配量按试剂盒说明书配置。3、加入DNA模板。标准品与标本同步扩增，可得出相应的标准曲线。同时，阴阳性对照品也进行扩增，质控此批样本，以保证其准确性。5、读取结果。扩增仪配有相应的软件，扩增完毕后能直接读出各标本的相对定量值。
检测原理：将一个样本分成几十到几万份，再将其分配到不同的反应单元中，使每个微滴单元包含一个或多个拷贝的核酸分子（即DNA模板），每个单元都会对目标分子进行扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号强度，带入泊松分布即可计算出起始模板DNA浓度。
微滴式数字PCR检测流程：其方法与qPCR类似，分为以下几步。
6、结果判读。使用微滴数字PCR仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出DNA浓度。
优势：操作方便、特异性强、灵敏度高、定量准确、等优点。使其成为分子生物学研究中的重要工具。
目前，dPCR主要为微滴式dPCR（ddPCR）和芯片式dPCR（cdPCR）两种技术。由于芯片式dPCR成本较高，微滴式dPCR越来越受到企业的青睐。
1、dPCR比qPCR准确度与精密度高。qPCR的效率会受到很多因素影响。例如：试剂保存不当导致部分样本降解、标准曲线偏斜导致CT值受到影响。dPCR 将样本分成若干小的 PCR 反应分区，可实现单分子检测，避免模板间的竞争效应的影响，可提高目的序列的检测准确度。由于dPCR较少受到扩增效率的影响，因此具有更高的准确度与精密度。qPCR面对小的差异较弱，dPCR则可识别差异较小的拷贝数。2、dPCR比qPCR重复性和通用性高。qPCR只能实现相对定量，即必须使用标准品生成标准曲线，才能进行定量。dPCR是绝 对定量，不需要利用标准品绘制标准曲线，也不依赖荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，直接计算样品中目的核酸分子的个数，可实现绝 对定量，重复性和通用性高 。因此dPCR可用于常规qPCR所需的标准品定量，具有计量学意义 。3、dPCR比qPCR抗干扰能力和稳定性强。qPCR 是依赖每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数进行定量，而dPCR 是终点法，非实时扩增定量，因此较少受到样本中可能存在的抑制物影响 ，可应用在复杂临床样本（血液、粪便和组织等）中的病原微生物或其它标志物的检测。由于dPCR相当于稀释样品并读取数据，因此dPCR比qPCR对抑制剂的抗干扰能力更高。
在市场普及方面，qPCR技术更加成熟，具有大量商业化产品。但 dPCR属于新开发的技术，市场占有率显然不如qPCR高，且价格昂贵。qPCR更适合于高通量分析，且动态范围广。
市面上，荧光定量PCR的主流品牌包括罗氏、ABI、伯乐等。受国家出台的相关疫情防控政策的强力驱动，荧光定量PCR需求量猛增，供不应求，市场也由原来的买方市场变为卖方市场。供求关系反转释放出了巨大市场机会，加之荧光定量PCR产品发展成熟，技术门槛相对不高，导致市场涌入大量竞争者。在未来的分子诊断市场当中仍然占有主导地位。dPCR主流品牌包括伯乐、Stilla Technologies、小海龟科技等。dPCR虽具有较高的敏感度、重复性和稳定性，已在相应领域获得了应用，但因价格昂贵、通量低、检测范围受限等因素影响，在未来广泛应用的道路上仍具有许多挑战，但是因其不需要制作标准曲线，以绝 对定量的优势，对低拷贝核酸，尤其是缺乏标准品的病原体检测和定量提供了一种新的发展方向，dPCR 技术的发展也会更利于病原体的诊断、治疗及耐药分析监测的发展。
部分图片来源：仪器无忧网。
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