文章来源:MIR医学仪器与试剂
在目前的分子诊断实验室当中,磁珠法提取和硅胶膜离心柱法提取是最常用,也是应用最广泛的两种提取方法。那么,这两种提取方法各有什么特点?提取流程与原理又是什么呢?在实验检测过程中,该如何选择呢?
磁珠法吸附原理:运用纳米技术,对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。核酸结合到磁珠上主要依靠静电作用、疏水作用和氢键作用。在盐酸胍、异硫氰酸胍和外加磁场的作用下,能从血液样本中分离出DNA,并洗去非特异性吸附的杂质,得到纯化后的DNA,可应用于实验室检测。磁珠法提取的原理,具有传统DNA提取方法无法比拟的优势,可以应用在血液、组织、拭子、鼻咽分泌物等样本之中。
加样
需要在样本处理板中加入样本及蛋白酶K,利用蛋白酶K将蛋白质消化成小片段,促进核酸与蛋白质分离。
上机
将样本处理板放入核酸提取仪及安装磁力套,每台核酸提取仪都带有磁力棒,磁力棒用于吸附磁珠,在使用之前需要安装磁力套,防止样本之间的交叉污染。
裂解
通过机械臂运动及加热实现反应液的混匀,使其充分反应,促使细胞裂解,释放核酸。
结合
释放磁珠,充分混匀,利用磁珠在高盐低PH值下对核酸具有很强亲和力的特点,吸附核酸。
洗涤
机械臂移动到洗涤液中,充分混匀,去除各种杂质。
干燥
机械臂静置5分钟,使磁力棒上吸附的磁珠晾干。
洗脱
机械臂移动到洗脱液中,充分混匀,结合的核酸与磁珠分离。最终得到的洗脱液就是提取纯化后的核酸。
裂解及消化
将新鲜血液转移到离心管中,加入蛋白酶K裂解液促使细胞破碎,核酸与蛋白质分离。再加入消化缓冲液,使蛋白质变性、消化,暴露DNA。
孵育
恒温金属浴70度孵育10分钟,提供适宜的温度,有助于蛋白质消化和分解。
沉淀
加入无水乙醇,它可以任意比与水互溶,夺取DNA周围的水分子,沉淀DNA。
吸附
转移到吸附柱以后经过高速离心或者负压法的操作,由于硅胶模对核酸有较强的亲和力和吸附力,核酸会特异地吸附到硅胶膜上。
去杂质
加入漂洗液,硅胶模对蛋白质、多糖、脂类基本不吸附,在高速离心以后被甩出离心柱。
干燥及洗脱
晾干5分钟,之后加入洗脱液,把硅胶模上吸附的核酸洗脱下来,在高速离心之后就可以得到纯化的核酸溶液。
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珠海宝锐生物科技有限公司成立于2012年,专注于核酸断试诊剂核心原料领域,是珠海市独角兽种子企业、广东省专精特新企业、国家高新技术企业。成功研制了多个系列的高品质分子诊断用酶和配套试剂,已得到众多国内知名企业和研究机构的认可,并广泛应用在诊断试剂的研发和生产中。同时,宝锐大力投入mRNA疫苗原料、NGS建库试剂、数字PCR扩增试剂、STR多重检测试剂等多项研究,相关新品陆续上市。