恒温扩增技术是PCR的补充还是代替？

文章来源：基因谷

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中，恒温扩增技术便是其中一种，与其他的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。

当前常见的等温扩增技术有环介导等温扩增技术、链替代等温扩增技术、滚环等温扩增技术、依赖解旋酶等温扩增技术、依赖核酸序列等温扩增技术、单引物等温扩增技术和核酸快速等温检测放大等技术。为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。

环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3`末端末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。

LAMP的优势：

（1）扩增效率高，能够在1h内有效的扩增1-10拷贝的目的基因，扩增效率是普通PCR的10倍-100倍

（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备

LAMP的劣势：

（1）对引物的要求特别高

（2）扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断

（3）由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果

依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA)是在PCR基础上发展起来的一种新技术，是由1对带有T7启动子序列的引物引导的连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术，反应在41℃进行，可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍，比常规PCR法高1000倍，不需特殊的仪器。

该技术一出现就被用于疾病的快速诊断和病人血清中HIV-1的定量检测。尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术（通过反转录形成单链DNA模板),NASBA相比则有自己的优势：可以在相对恒温的条件下进行（一般恒温为41摄氏度）。该技术用于医学诊断，相对传统的PCR技术更为稳定，准确。

NASBA的优势：

（1）它的引物上带有T7启动子序列，而外来双链DNA无T7启动子序列，不可能被扩增，因此该技术具有较高的特异性和灵敏度。

（2）NASBA将反转录过程直接合并到扩增反应中，缩短了反应时间。

NASBA的劣势：

（1）反应成分比较复杂

（2）需要3种酶使得反应成本较高

（3）对DNA病毒的检测上NASBA就显得不是那么适合

1998 年建立的滚环扩增 (RCA) 是模拟自然界微生物环状 DNA 的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。在具有链置换活性的 DNA 聚合酶作用下由一条引物与环形 DNA 模板的链置换合成，实现环状 DNA 模板的体外等温线性扩增。可分为线性扩增 (单引物 RCA)、指数扩增、多引物扩增和信号扩增RCA。

这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。

RCA的优势：

（1）高灵敏度，RCA有很强的扩增能力，线性RCA的效率可达到105倍，而指数RCA的效率可达到109倍，具有检测单拷贝的潜力。

（2）高序列特异性，可以区分单一位点的不同模式

（3）扩增产物经过磷酸化处理后可直接用来测序

（4）高通量，RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增。

RCA的不足：

（1）琐式探针常接近100bp,合成费用较高。

（2）信号检测时存在背景干扰问题

SPIA的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分组成。在反应过程中，RNaseH不断降解引物区DNA/RNA双链中的RNA部分，暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。

依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术 (HDA) 是美国NEB 公司于 2004 年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内 DNA 复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开 DNA 双链，再由 DNA 单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的zui适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

链替代扩增 (SDA) 技术是基于在靶DNA两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶延伸缺口3`端并替代下一条DNA链。被替代下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。SDA的基本系统包括一种限制性内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。

SDA的优点：
（1）扩增效率高
（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备

SDA的不足：
（1）SDA产物不均一，在SDA循环中总要产生一些单、双链产物，用电泳法检测时必然要出现拖尾现象。
（2）SDA产物不可能直接用于克隆、测序和表达
（3）SDA产物的检测手段有待提高，目前主要的方法是荧光偏振检测，需要用到荧光分光分光光度计，这限制了SDA在临床的广泛应用。

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